====== ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere. ======

<WRAP center round download 20%>
{{:aok:biokemia:masodik_felev:pirkin.pdf|gyakorlati jegyzet}}
</WRAP>


===== Piruvát-kináz =====

  * A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ.
  * A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között.
  * Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP -> piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja.
  * A reakcióhoz Mg<sup>2+</sup> szükséges:

**PEP + Mg<sup>2+</sup> + ADP -> piruvát + Mg<sup>2+</sup> + ATP**

  * A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban, az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg.
  * A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll: 
     * az ATP, az L-alanin gátolja
     * a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti. (feed forward)
  * kovalens szabályozás:
     * glukagon -> foszforilál (aktiválja a cAMP függő protein-kinázt) -> gátol
     * inzulin -> foszfoprotein-foszfatázt aktivál = defoszforilál -> aktivál
===== Mérés =====

  * Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá.
  * A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi.
  * A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.

===== Kivitelezés =====

==== Az ATP és a FDP szabályozó hatásának vizsgálata ====

  * vakminta: médium + PEP + NADH
  * behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert
  * LDH
  * PK-L
  * 2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat
  * ADP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
  * ATP -> 2 percig mérünk változást (a reakció lassul)
  * FDP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH)

==== Az alanin és FDP szabályozó hatása ====

  * az összeállítás ugyanaz, mint az előbb
  * ADP -> 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
  * alanin -> 3 perc inkubálás
  * alanin ismét -> 2 percig mérünk, a reakció le is állhat
  * FDP -> aktiválja az enzimet, a reakció újra indul

----

  * A fentieket megismételjük az M-izoformára is.
  * A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az extinkciós koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet.