====== Malonát hatása a szukcinát-dehidrogenázra, az enzim aktivitásának mérése. ======

<WRAP center round download 20%>
{{:aok:biokemia:masodik_felev:szukcinat.pdf|gyakorlati jegyzet}}
</WRAP>


===== Enzimek kompetitív gátlása =====

  * Kompetitív gátlás esetén a gátlószer olyan vegyület, ami szerkezetileg hasonlít a szubsztrátra.
  * A szabad enzimhez kötődve megakadályozza a szubsztrát kapcsolódását, mintegy verseng a szubsztráttal az enzimhez való kötődésben.
  * A szubsztrátkoncentráció emelésével a gátlás kivédhető. A kompetitív inhibitor hatására látszólag csökken az enzim affinitása a szubsztráthoz, tehát a K<sub>M</sub> érték nő.
  * A v<sub>max</sub> nem változik, mivel az ES-komplex kialakulása gátolt, de elbomlása nem!

{{ :aok:biokemia:masodik_felev:szukc1.png |}}

  * Ha a hányadosban az ES mennyisége csökken, mert az enzim egy része EI-komplexet képez, a tört értéke, azaz a K<sub>M</sub> nő.
  * **Látszólagos kompetitív gátlás** esetén, az inhibitor nem az enzim aktív centrumához kapcsolódik, hanem valamely más csoportjához, és az enzimfehérje harmadlagos szerkezetének megváltoztatásával gátolja annak szubsztrátkötő képességét. Kinetikailag nem különböztethető meg a valódi kompetitív gátlástól. Az allosztérikus gátlások egy része is ilyen.

===== A szukcinát-dehidrogenáz =====

  * A szukcinát-dehidrogenáz a citrát-ciklus egyik enzimje, ezért aktivitásának fokozása vagy gátlása közvetve befolyásolja a metabolitok többségének lebontását.
  * Az enzim **kofaktor**a a katalízis során a **FAD**, ami a reakció során FADH<sub>2</sub>-vé redukálódik:

**szukcinát + E-FAD -> fumarát + E-FADH2**

  * Az enzim a mitokondrium belső membránban lokalizálódik, amely mikroszóma-homogenizátumban szem veszíti el aktivitását.

===== Gyakorlat =====

  * Az enzim a szukcinátról átvett hidrogént aktivitásának mértékében képes megfelelő redox festéknek átadni:
**      E-FADH<sub>2</sub> + oxidált festék -> E-FAD + redukált festék**
  * Az oxidált festék színtelen, míg a redukált festék piros színű. A festék nem autooxidábilis.
  * Készítünk egy vak mintát, amiben mitokondriummembrán (E), puffer, szukcinát (S) és oxidált festék van, valamint a reakciót azonnal leállító FTF (formiát-triton-formalin).
  * Készítünk egy hígítási sort, amelyben egyre nagyobb koncentrációban van jelen a szukcinát (S), és nincs a mintában malonsav (I), valamint FTF. A többi komponens megegyezik a vakkal.
  * Készítünk egy hígítási sort, amelyben minden megegyezik az előző sorral, de ebben jelen van a malonsav (I) is.
  * Az elegyeket 10 percen át 37 <sup>o</sup>C-on inkubáljuk, majd FTF-fel az összes mintában leállítjuk a reakciót.
  * A mintákat 490 nm-en fotometráljuk, amikor is az extinció arányos lesz a redukálódott festékkel, tehát közvetve magával a produktummal, a fumaráttal.
  * A Lambert-Beer törvény segítségével adott ε ismeretében produktum koncentrációt számolhatunk:

{{ :aok:biokemia:masodik_felev:szukc2.png |}}

  * Az aktivitást koordinátarendszerben ábrázolva, akár a MM-kinetika alapján, akár a reciprokábrázolással igazolhatjuk, hogy a malonsav gátolja a szukcinát-dehidrogenázt, ráadásul mivel a K<sub>M</sub> érték nő, a v<sub>max</sub> nem változik (grafikus ábrázolásból leolvasható) a gátlás kompetitív volta is igazolt.