ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere.

• A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ.
• A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között.
• Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP → piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja.
• A reakcióhoz Mg²⁺ szükséges:

PEP + Mg²⁺ + ADP → piruvát + Mg²⁺ + ATP

• A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban, az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg.
• A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll:
  • az ATP, az L-alanin gátolja
  • a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti. (feed forward)
• kovalens szabályozás:
  • glukagon → foszforilál (aktiválja a cAMP függő protein-kinázt) → gátol
  • inzulin → foszfoprotein-foszfatázt aktivál = defoszforilál → aktivál

• Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá.
• A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi.
• A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.

• vakminta: médium + PEP + NADH
• behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert
• LDH
• PK-L
• 2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat
• ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
• ATP → 2 percig mérünk változást (a reakció lassul)
• FDP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH)

• az összeállítás ugyanaz, mint az előbb
• ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
• alanin → 3 perc inkubálás
• alanin ismét → 2 percig mérünk, a reakció le is állhat
• FDP → aktiválja az enzimet, a reakció újra indul

• A fentieket megismételjük az M-izoformára is.
• A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az extinkciós koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet.