Pont annyi, amennyit beleteszel.



Loading


ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere.

Piruvát-kináz

  • A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ.
  • A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között.
  • Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP → piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja.
  • A reakcióhoz Mg2+ szükséges:

PEP + Mg2+ + ADP → piruvát + Mg2+ + ATP

  • A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban, az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg.
  • A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll:
    • az ATP, az L-alanin gátolja
    • a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti. (feed forward)
  • kovalens szabályozás:
    • glukagon → foszforilál (aktiválja a cAMP függő protein-kinázt) → gátol
    • inzulin → foszfoprotein-foszfatázt aktivál = defoszforilál → aktivál

Mérés

  • Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá.
  • A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi.
  • A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.

Kivitelezés

Az ATP és a FDP szabályozó hatásának vizsgálata

  • vakminta: médium + PEP + NADH
  • behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert
  • LDH
  • PK-L
  • 2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat
  • ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
  • ATP → 2 percig mérünk változást (a reakció lassul)
  • FDP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH)

Az alanin és FDP szabályozó hatása

  • az összeállítás ugyanaz, mint az előbb
  • ADP → 2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)
  • alanin → 3 perc inkubálás
  • alanin ismét → 2 percig mérünk, a reakció le is állhat
  • FDP → aktiválja az enzimet, a reakció újra indul

  • A fentieket megismételjük az M-izoformára is.
  • A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az extinkciós koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet.

QR Code
QR Code ADP, ATP, fruktóz-1,6-biszfoszfát és alanin hatása L és M típusú piruvát-kináz izoenzimekre. A mérés módszere. (generated for current page)